生物原子力顯微鏡在生物學研究中展現(xiàn)出獨特優(yōu)勢，能夠在近生理條件下觀察生物樣品的納米級形貌與力學特性。對于初學者而言，樣品制備是獲得高質量AFM圖像的關鍵第一步。本指南將系統(tǒng)介紹生物原子力顯微鏡樣品制備的全流程。
一、核心原則與準備工作
生物AFM樣品制備的核心原則是：保持樣品天然狀態(tài)、確?；浊鍧嵠秸?、優(yōu)化固定方法。實驗前需準備：AFM專用云母片或玻璃基底、純水與緩沖液、微量移液器、新鮮制備的生物樣品（蛋白質、DNA、細胞或組織切片），以及適當?shù)墓潭ㄔ噭ㄈ缥於?，濃度通常?.1%-2%）。
二、分步制備流程
1.基底處理
云母片是常用基底，因其表面原子級平整且易于剝離出新表面。使用膠帶剝離云母表層3-4次，暴露新鮮表面。若使用玻璃或硅片，則需依次用丙酮、乙醇和純水超聲清洗各10分鐘，氮氣吹干。
2.樣品沉積
將1-10µL樣品溶液（濃度建議：蛋白質0.01-0.1mg/mL，DNA1-5ng/µL）滴加在基底中央，室溫靜置吸附5-15分鐘。吸附時間需優(yōu)化：時間過短樣品稀疏，過長可能形成多層聚集。
3.沖洗與固定
用30-50µL緩沖液（如PBS或Tris-HCl）輕柔沖洗表面3次，去除未吸附樣品。注意沖洗角度應低于30°，避免直接沖擊沉積區(qū)域。若需化學固定，滴加適量戊二醛溶液（常用0.1%）反應2-5分鐘，隨后用緩沖液沖洗。
4.液體模式準備
對于液體AFM成像（保持生物活性關鍵），在樣品池中加入適量緩沖液全覆蓋樣品。避免氣泡產生，輕輕傾斜樣品池使液體自然流布。
三、關鍵技巧與常見問題
-濃度優(yōu)化：初次實驗建議設置濃度梯度，找到單分子分散與覆蓋度的平衡點
-防污染：全程使用無塵手套、在潔凈環(huán)境中操作，避免灰塵顆粒影響成像
-緩沖液選擇：避免高鹽濃度（通常<150mM），防止鹽結晶干擾
-細胞樣品特殊處理：需先用多聚賴氨酸處理基底增強細胞粘附，培養(yǎng)后輕柔沖洗
四、質量控制與上機前檢查
制備完成后，先用光學顯微鏡檢查樣品分布均勻性。成功制備的樣品應在AFM輕敲模式下呈現(xiàn)清晰、分散良好的結構。避免樣品過度聚集或基底大面積空白。
